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色譜柱可分為填充柱和開(kāi)管柱兩大類(lèi)。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤(pán)管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。
1.網(wǎng)上對(duì)柱子是否可以反沖一直有爭(zhēng)論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正者用，還是反著用。具體到各型號(hào)柱子不僅是ODS柱，其他如，正向柱、氨基柱、離子交換柱等都有解釋。
答：一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)的柱子不能反沖，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染，我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。
2.我在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，剛開(kāi)始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調(diào)到40%乙腈，RT沒(méi)有變化，30%也沒(méi)有變化，一直調(diào)到20%的時(shí)候，RT突然變到了約13分鐘，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因?我用的是離子交柱。
答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單，需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如，分析物是什么情況，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?
3.對(duì)于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?
答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽，尤其重要。因?yàn)椋肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。
如果要加快平衡時(shí)間，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡，目的是：將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。
4.測(cè)定多肽，一般采用什么柱子?流動(dòng)相是乙腈和水，還有微量的TFA。特別是像類(lèi)似三肽的短肽，應(yīng)該怎么選擇柱子?
答：分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定，也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。
5.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)?
答：氨基柱測(cè)酸性樣品，應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0%NH3的乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨)，之后，再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如，0.1%。
6.色譜柱的技術(shù)都有哪些?比如，封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里?
答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù)，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累。
國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少，裝柱工藝也沒(méi)有*達(dá)到國(guó)外水平。另外，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料——裸硅膠，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān)，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比，差距很大。
7.色譜柱技術(shù)的差距在哪里?
答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù)，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累。
國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外，因?yàn)?，裝柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少，裝柱工藝也沒(méi)有*達(dá)到國(guó)外水平。另外，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料——裸硅膠，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān)，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比，差距很大。
8.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題，我也拆下來(lái)清洗過(guò)，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問(wèn)題解決了，但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢?
答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因?yàn)椋尤肽愎瘟诵┨盍?，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問(wèn)題解決，但是，今后還會(huì)有同樣問(wèn)題，再掛，那么不小心刮，影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱。
9.如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間，需要做什么保護(hù)嗎?
答：對(duì)一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。
10.流動(dòng)相中加入適量的四氫fu喃可以改善峰形的機(jī)理是什么?
答：《液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說(shuō)：甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、四氫fu喃是偶極溶劑，應(yīng)該除了極性影響，還有另外的影響因素，至于分離機(jī)理，還是比較復(fù)雜的，不能看成是個(gè)方法。
11.關(guān)于色譜柱的填裝問(wèn)題!我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況：
?、?lài)?guó)外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣(mài)到國(guó)內(nèi);
②國(guó)外生產(chǎn)填料，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售;
?、蹏?guó)內(nèi)生產(chǎn)填料，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售。
一般情況下，第1種情況賣(mài)的貴，也質(zhì)量!可是我就不明白了：如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話(huà)，那么填裝上國(guó)內(nèi)也跟不上去嗎?為什么換在國(guó)內(nèi)填裝就會(huì)出現(xiàn)或多或少的一些小問(wèn)題呢?
答：國(guó)內(nèi)填裝會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量小問(wèn)題，和國(guó)內(nèi)目前普遍做事沒(méi)有國(guó)外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧。如果工藝技術(shù)上沒(méi)有問(wèn)題，又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施，國(guó)內(nèi)填裝和國(guó)外填裝并無(wú)區(qū)別。
12.國(guó)產(chǎn)色譜柱在市場(chǎng)上占有比例如何啊?
答：國(guó)內(nèi)色譜柱市場(chǎng)還沒(méi)有人進(jìn)行過(guò)科學(xué)統(tǒng)計(jì)，連一年色譜柱銷(xiāo)售總量也眾說(shuō)紛云，更別說(shuō)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計(jì)是占30%左右吧。
13.預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問(wèn)題!原來(lái)分析中藥品種時(shí)，我一直都是用保護(hù)柱。但來(lái)到新公司后，發(fā)現(xiàn)大家都沒(méi)有使用，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒(méi)找到一個(gè)，也就是說(shuō)大家從來(lái)都沒(méi)有用過(guò)。后來(lái)問(wèn)一個(gè)老員工，說(shuō)是有可能影響藥品分析。我就想問(wèn)：安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類(lèi)的抗生素。
答：應(yīng)該這樣說(shuō)，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在但是如果保護(hù)柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。
頭孢類(lèi)的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個(gè)篩板)，制劑的話(huà)，如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大，那還是配個(gè)保護(hù)柱。
14.用的是四元梯度泵：A：50%甲醇;B：50%水， 經(jīng)常出現(xiàn)停或進(jìn)氣泡這是什么原因?
答：水/甲醇比例在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。50：50接近了這個(gè)極值，柱壓是比較高的，但，影響柱壓大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑，你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱?系統(tǒng)壓力高，可能會(huì)因溶劑泵中的過(guò)濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng)，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過(guò)濾頭。
15.填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明?
答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度>20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20µm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種
?、?高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;
?、?徑向加壓法，Waterszhuan利;
?、?軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;
④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。為什么以20μm為分界點(diǎn)?
16.想請(qǐng)您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測(cè)器嗎?
答：反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因?yàn)?，有污染物反沖出來(lái)，當(dāng)然不連檢測(cè)器，出液端直接接到廢液瓶就可以。
17.如果不使用不銹鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完*接頭匹配問(wèn)題?
答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個(gè)，VICI，Upchurch，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。
18.有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑(2～5μm)的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。那么，你們?cè)谑褂谜f(shuō)明書(shū)中會(huì)說(shuō)明前后篩板的孔徑嗎?
答：如果前后篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)，廠商肯定也會(huì)在說(shuō)明書(shū)里特別提到的。
19.我在做多肽藥物時(shí)遇到下列問(wèn)題：
1)基線(xiàn)不穩(wěn)定波動(dòng)大，流動(dòng)相 A ：
1%TF，A：水溶液，B：1%TFA乙腈溶液檢測(cè)波長(zhǎng)210nm流速1.0mL/mL 什么原因?怎么解決?TFA有什么作用?流動(dòng)相中不加TFA見(jiàn)不到主峰，基線(xiàn)良好。
2)做完肽類(lèi)樣品時(shí)怎么沖洗C18比較好;
3)藥典上介紹測(cè)定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為30nm，30nm與10nm對(duì)結(jié)果有什么區(qū)別?
答：應(yīng)該是起“離子對(duì)”的作用吧。在做多肽類(lèi)樣品的時(shí)候，300A孔徑的填料相對(duì)100A孔徑肯定要選擇性好點(diǎn)，也就是分離度相對(duì)比較好點(diǎn)。流動(dòng)相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，使用三氟yi酸(TFA)作為離子對(duì)試劑是常見(jiàn)的手段。流動(dòng)相中的三氟yi酸通過(guò)與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來(lái)改善峰形、克服峰展寬和拖尾問(wèn)題。
※三氟yi酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，三氟yi酸的紫外大吸收峰低于200nm ，對(duì)多肽在低波長(zhǎng)處的檢測(cè)干擾很小。
20.waters，Atlantis C18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?
答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù)：
流動(dòng)相中不含緩沖鹽：
分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min
流動(dòng)相中含有緩沖鹽：
分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易長(zhǎng)菌，使用時(shí)間不可超過(guò)3天);
水性柱保存體系也不特別：
短期保存在所用的流動(dòng)相中(不含緩沖鹽)，中長(zhǎng)期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。
21.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?
答：短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。
22.磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，為什么，是因?yàn)榕c醋酸鹽，枸椽酸鹽相比，基團(tuán)小嗎，使用磷酸鹽緩沖液與其它緩沖液相比，會(huì)使色譜柱壽命縮短多少?
答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些。但用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。
23.反相離子對(duì)色譜法中，離子對(duì)是如何起作用的，是離子對(duì)試劑的非極性端溶解在填料的非極性端里，解離端伸向流動(dòng)相，對(duì)含胺化合起離子交換作用，還是樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)，還是這種結(jié)合物是在解離與結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡之中?
答：首先離子對(duì)試劑的解離端和目標(biāo)離子形成離子締合物，降低其極性，這樣就能較好的在柱子上保留。再者，根據(jù)疏水效應(yīng)理論，離子對(duì)試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的，這樣更容易在柱子上保留，所以我認(rèn)為離子對(duì)試劑作用是混合保留機(jī)制，即純粹的反相保留和離子對(duì)保留機(jī)制共同作用。
24.四烷基季銨鹽(如，四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等)在水中電離后，也形成了類(lèi)似N+H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N+(CH2CH2CH2CH3)4，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si-O-產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，此類(lèi)離子對(duì)用的比較少，但它的作用僅是掩藏Si-O-嗎，它對(duì)物質(zhì)的保留性能有何影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)胺化物時(shí)，流動(dòng)相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質(zhì)保留的趨勢(shì)，而加入三乙胺則會(huì)降低物質(zhì)的保留能力?
答：前面提到的四丁基氫氧化銨等離子對(duì)試劑確實(shí)不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對(duì)試劑用得普遍，原因是酸類(lèi)極性物質(zhì)很容易通過(guò)降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力，降低pH可抑制酸的電離，使酸處于中性狀態(tài)而與疏水碳鏈的作用力增強(qiáng)。而堿類(lèi)分析物則受硅膠基質(zhì)pH上限的嚴(yán)重影響(以前上限是8，后來(lái)抬到10，直到近雜化硅膠才將pH上限提到12左右)。
銨鹽類(lèi)離子對(duì)試劑確實(shí)有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結(jié)合，外露的陽(yáng)離子親水端和酸陰離子作用，從而提高其保留能力。當(dāng)然同樣還有第二種解釋機(jī)理，離子對(duì)試劑先和分析物結(jié)合，掩藏極性基，從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差，這種情況下，認(rèn)為后面的結(jié)合機(jī)理占上風(fēng)的可能性更大。
檢測(cè)胺類(lèi)化合物，加入三乙胺預(yù)先和硅醇基結(jié)合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。
25.同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前?
答：色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后，保留時(shí)間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì)，還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜，有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后。不過(guò)你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候，注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個(gè)分析方法用專(zhuān)門(mén)的色譜柱，長(zhǎng)遠(yuǎn)看，這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用。
26.HPLC柱前衍生和柱后衍生的相關(guān)問(wèn)題?1)為什么要衍生?2)衍生化的分類(lèi)?3)進(jìn)行衍生，適用的化合物有哪些?4)進(jìn)行衍生化的要求有哪些?5)柱前衍生和柱后衍生的優(yōu)缺點(diǎn)?
答：色譜技術(shù)中的化學(xué)衍生法系指在色譜過(guò)程中用特殊的化學(xué)試劑(一般稱(chēng)為衍生化試劑或標(biāo)記試劑)使樣品成分轉(zhuǎn)變相應(yīng)的衍生物之后進(jìn)行分離檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè)的方法。
目的為：
1.將紫外—可見(jiàn)強(qiáng)吸收功能基團(tuán)引入被檢測(cè)對(duì)象或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌?，以提高檢測(cè)靈敏度;2.提高對(duì)分析樣品的分離和選擇性。
從是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)的角度，化學(xué)衍生法分為在線(xiàn)on line)與離線(xiàn)∣Off line)兩種。從發(fā)生衍生化的場(chǎng)合，分為柱前衍生法pre-columnderivatization)與柱后衍生法(post-columnderivatization)兩種。目前，在HPLC中，以離線(xiàn)的柱前衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱前衍生法)與在線(xiàn)的柱后衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱后衍生法)使用居多。
27.多個(gè)樣品不好不離的時(shí)候，請(qǐng)問(wèn)該怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度?
答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮，柱效、選擇性和保留因子。可通過(guò)減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性;有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子，也可提高分離度。
28.苯基柱，氰基柱該什么時(shí)候考慮用?
答：苯基柱用于含苯環(huán)的芳香族化合物的測(cè)定時(shí)，具有較高的選擇性。CN柱可作為一個(gè)保留能力弱的反相柱使用，也可作為一個(gè)活性降低的正相柱使用(保留時(shí)間比硅膠柱和氨基柱低很多)。
29.同樣類(lèi)型柱子還有長(zhǎng)度，粒徑等差異，這些該怎么去選擇?
答：長(zhǎng)度和粒徑都是用來(lái)改變柱效的，選擇原則是夠用就好。
30.我前幾天剛剛裝上一個(gè)新的C18柱，在進(jìn)樣之前我用100%的甲醇沖了半個(gè)多小時(shí)。剛才看到上面寫(xiě)的要活化什么的?不知道我只沖洗半小時(shí)就開(kāi)始用對(duì)柱子有沒(méi)有影響?對(duì)出峰什么的有沒(méi)有影響呢?
答：不是所有的測(cè)定，都需要對(duì)新柱子用所測(cè)樣品老化。但先按方法程序進(jìn)樣幾針，觀察到峰面積保留時(shí)間不再有明顯變化，再開(kāi)始正式測(cè)定，這是一個(gè)好習(xí)慣。按你現(xiàn)在的做法，如果針和第二針的峰面積、保留時(shí)間沒(méi)有變化，就繼續(xù)做沒(méi)影響吧。
31.現(xiàn)在色譜柱和儀器的接口還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化嗎，除了檢測(cè)池的出入管較小外，色譜柱的接口與peek頭不匹配的有哪個(gè)型號(hào)的色譜柱，以后使用的時(shí)候需要注意一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用過(guò)金屬接頭的色譜柱再換成PEEK頭，常易漏液，這是因?yàn)榻饘兕^易使色譜柱接口變形嗎?
答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個(gè)，VICI，Upchurch，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。
32.普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎?正相色譜體系中常用也普通的是那種色譜柱。正相柱在使用過(guò)程中與反向柱相比有什么需要注意的地方?
答：普通C18柱作為正相柱使用，我還沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動(dòng)相的極性大，反過(guò)來(lái)，流動(dòng)相極性大就是反相。C18固定相屬于疏水性相對(duì)比較強(qiáng)的，疏水性強(qiáng)就是極性很弱，應(yīng)該找不出極性比它更弱的流動(dòng)相了。
正相體系常見(jiàn)的柱子有：硅膠柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，普通的應(yīng)該就是硅膠柱。正相柱和反相柱比，需要注意的是水分，正相柱對(duì)水分非常敏感，流動(dòng)相中水分含量的些微變化對(duì)保留時(shí)間影響很大，因此正相柱測(cè)定前平衡時(shí)間需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。
33.色譜柱的柱頭類(lèi)型與不銹鋼毛細(xì)管接頭有6種連接方式(在講義里面提到)，那么我們用戶(hù)一般是液相色譜儀是固定某一個(gè)廠家，而是根據(jù)樣品檢測(cè)需要更換不同類(lèi)型的色譜柱，那么怎么判斷我所購(gòu)買(mǎi)的色譜柱是否與不銹鋼毛細(xì)管是否匹配呢，我之前只是知道安捷倫和waters都有規(guī)定他們自己家的柱子與自己家的儀器配套是合適的，而其他廠家的色譜柱都很少提及，在不知道的情況下，我們?cè)撛趺催x擇?月旭的色譜柱柱頭類(lèi)型屬于哪一種類(lèi)型呢?
答：不銹鋼毛細(xì)管接頭有個(gè)缺點(diǎn)，用過(guò)一次后卡匝位置和距離毛細(xì)管末端的長(zhǎng)度就固定死了。如果下次用的色譜柱的柱頭接口深度和原來(lái)的不同，就容易產(chǎn)生死體積和泄漏。產(chǎn)生的死體積一般不大，如果只引起柱效的稍微下降而沒(méi)引起拖尾，這個(gè)問(wèn)題就容易被忽略。引起大家關(guān)注的是泄漏，如果用了新柱子，發(fā)現(xiàn)和毛細(xì)管的接口處有泄漏，就可以判斷是接頭的匹配問(wèn)題。的判斷方法還是：詢(xún)問(wèn)一下廠商色譜柱柱頭的類(lèi)型和柱頭接口的深度，然后和毛細(xì)管接頭的規(guī)格比較。
如果用peek接頭，發(fā)生問(wèn)題的情況就大大減少，因?yàn)?，peek接頭卡匝位置是不固定的。
接頭與色譜柱的匹配，并沒(méi)有在實(shí)際色譜應(yīng)用中造成很大的問(wèn)題，有很多人都沒(méi)有關(guān)注到這個(gè)問(wèn)題。一方面原因是使用peek接頭的情況很普遍，另外，如果發(fā)現(xiàn)不匹配，換個(gè)毛細(xì)管接頭還是非常方便的。
34.相對(duì)于氣相色譜，液相的優(yōu)勢(shì)在哪里?做防腐劑分析時(shí)，流動(dòng)相加入乙酸銨才可以出峰，原理是什么?
答：液相和氣相相比的優(yōu)勢(shì)有很多,我認(rèn)為主要在于應(yīng)用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質(zhì)的分析測(cè)定，對(duì)象大部分是基礎(chǔ)化工原材料;而任何能溶解于某溶劑的物質(zhì)都能用液相分析，適用對(duì)象是分子量從幾十到幾萬(wàn)的廣大范圍。在制藥、化工、環(huán)保、食品和刑偵等諸多重要領(lǐng)域，液相都已成為主導(dǎo)的分析分離工具。也有兩者都能應(yīng)用的交叉情況，但液相的制樣更簡(jiǎn)單。液相色譜的出現(xiàn)克服了氣相色譜不能直接用于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子化合物的弱點(diǎn)。
35.您提到“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會(huì)降低pH使用范圍。”，既然這樣，經(jīng)常使用，柱子壽命是否也下降的快呀?
答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些，但，用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。
36 CN柱的保存需要在低溫條件，但是，又不能太低，使固定相凍結(jié)，怎么控制這個(gè)溫度?怎么判斷固定相是否被凍結(jié)?固定相凍結(jié)后會(huì)是什么樣的現(xiàn)象?
答：所謂低溫儲(chǔ)存，就是放到陰涼處或者放到冰箱的冷藏室。儲(chǔ)存液只要不是純水，冰點(diǎn)都比較低，純甲醇的冰點(diǎn)是零下90度以下了。
37.我們測(cè)試樣品時(shí)，經(jīng)常會(huì)關(guān)心柱壓是否太高，但是在購(gòu)買(mǎi)色譜柱時(shí)，并沒(méi)有說(shuō)每一根色譜柱的大使用壓力是多少?針對(duì)這樣的情況，用戶(hù)怎么判斷柱壓是否超過(guò)該柱的極限?
答：裝柱時(shí)的壓力比使用時(shí)高很多，所以柱壓對(duì)色譜柱本身在使用時(shí)沒(méi)有極限問(wèn)題存在，倒是一般儀器有個(gè)40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿(mǎn)足分析方法要求，柱壓只要儀器能承受就OK吧。
38.使用緩沖液不當(dāng)，使硅膠溶解并重新形成粉末后，會(huì)出現(xiàn)什么樣的異常情況?怎么處理?
答：出現(xiàn)異常就是柱壓升高。小粉末在流動(dòng)相不斷沖洗帶動(dòng)下，后會(huì)聚集在柱子出口端，沉積在后篩板。處理方法只有拆下后篩板進(jìn)行清洗或更換，但這樣做會(huì)影響到柱床，處理后柱效會(huì)下降。
39.今天才知道濾膜的材質(zhì)分了這么幾種：再生纖維素、聚四氟乙烯、硝酸纖維和醋酸纖維等，之前只知道有有機(jī)系和水系之分?各種不同材質(zhì)的濾膜適合于什么樣的樣品?
答：再生纖維素膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑;
聚四氟乙烯：適用于所有有機(jī)溶劑，酸和鹽;
尼龍66：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不適用與二甲基甲酰胺;
醋酸纖維：不適用有機(jī)溶劑，特別適用水基溶液。
40.我原來(lái)遇到個(gè)這樣的問(wèn)題，一直不知道原因。剛拿柱子做，色譜條件是成熟的，沒(méi)問(wèn)題，但是該條件下保留的物質(zhì)變的不被保留，比如，本來(lái)保留時(shí)間15分鐘卻怎么調(diào)比例都是2～3分鐘就出峰了，維護(hù)后，下次再使用又正常了，什么樣原因啊?
答：大可能是發(fā)生相塌陷了。C18柱和高密鍵合封尾的C8柱，在高含水流動(dòng)相下會(huì)發(fā)生相塌陷，后果就是保留能力大幅下降。用有機(jī)相比例較高的流動(dòng)相沖洗后，又可恢復(fù)正常性能。
41.UPLC色譜柱可以反沖嗎?HPLC的色譜柱可以簡(jiǎn)單反沖，但是，UPLC的色譜柱.也是一樣的嗎?如果壓力偏高，該怎么辦?
答：如果兩端篩板孔徑對(duì)稱(chēng)，UPLC柱應(yīng)該也是可以反沖的。發(fā)現(xiàn)壓力偏高，當(dāng)然也可以用反沖清洗的方法維護(hù)，UPLC柱和普通色譜柱比，只是壓力高一點(diǎn)，不應(yīng)該有什么特殊吧。
42.常規(guī)LC的柱子粒度小，柱效高，現(xiàn)在有3.5μm的常規(guī)柱，不知道用3.5μm*250的壓力與4.6μm的壓力相差多少?
答：一般柱子4.6mm×250mm指的是其內(nèi)徑和長(zhǎng)度。粒徑才用μm的單位，但一般標(biāo)的是5μm，也有3.5μm的。其它條件一樣，光粒徑是3.5μm和5μm的柱壓差別，理論上3.5μm柱子的柱壓是5μm柱子的(5/3.5)平方倍數(shù)，即，2.04倍，簡(jiǎn)單說(shuō)就是2倍。
43.因?yàn)?，不知道流?dòng)相已走完，液相色譜柱空走了大概一晚上，請(qǐng)問(wèn)這種情況下柱子還能用嗎?如果可以應(yīng)該如何再生?
答：能用的!可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去，但之后，多用流動(dòng)相沖沖，看到基線(xiàn)穩(wěn)定，就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗，然后，再檢測(cè)一下柱效，看柱子是否恢復(fù)，液相設(shè)置一下低壓限，這樣就不怕流動(dòng)相zou光而會(huì)損傷色譜柱。
44.在梯度洗脫的時(shí)候，如果整個(gè)時(shí)間程序越長(zhǎng)，保留時(shí)間的重現(xiàn)性越差，尤其是后出的峰重現(xiàn)性差更明顯，我猜估計(jì)是流量本身的誤差引起的，但是怎么盡量避免這種情況的出現(xiàn)，使保留時(shí)間重現(xiàn)性更好?
答：這個(gè)要控制好環(huán)境溫度和柱溫，易揮發(fā)的流動(dòng)相要適當(dāng)密封，同時(shí)，保留時(shí)間的漂移與儀器的精度也有關(guān)系。
45.我對(duì)聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有興趣，主要是它耐高溫、耐酸堿、但有關(guān)這方面的文獻(xiàn)很少，但對(duì)于他的分離效能我一直心里沒(méi)底，我的問(wèn)題有三：
1.分離效果與ODS比較，是相當(dāng)呢，還是更勝*，或是更差?
2.我原以為它是整體住，但看過(guò)資料后發(fā)現(xiàn)也是顆粒的比如，5μ，請(qǐng)問(wèn)該類(lèi)型的柱是否符合速率理論、是不是粒徑越小分離效果會(huì)幾何級(jí)的增加?
3.問(wèn)什么沒(méi)有1.7μ的這種柱出現(xiàn)呢?
答：聚合物基質(zhì)色譜柱的優(yōu)點(diǎn)你已經(jīng)提到了，它的缺點(diǎn)有：對(duì)小分子分離的柱效相對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱要低，表面衍生化修飾也沒(méi)有在硅膠表面豐富，機(jī)械強(qiáng)度低耐壓性不好，還有碰到某些有機(jī)溶劑會(huì)溶脹等。。。
聚合物基質(zhì)柱當(dāng)然也符合速率理論!它柱效低主要是因?yàn)?，分析物在聚合物固定相中的傳質(zhì)速度比在硅膠表面固定相中慢很多。不過(guò)粒徑越小柱效幾何級(jí)增加的規(guī)律還是有的。1.7μm的硅膠基質(zhì)填料也是近幾年才商品化，1.7μm的聚合物基質(zhì)沒(méi)出來(lái)也正常，或許永遠(yuǎn)都不出來(lái)了，因?yàn)?，聚合物耐壓差，粒徑做這么小，它根本承*這個(gè)高壓吧，但愿以后會(huì)有能抗高壓的聚合物填料研究出來(lái)。
46.我之前有了解到貴公司也有手性色譜柱，之前買(mǎi)過(guò)大賽璐的手性柱，其手性柱價(jià)格相比普通反相色譜柱，要高出很多倍，不知道是本身柱子裝填技術(shù)的難度大還是其他什么原因?它的主要技術(shù)關(guān)鍵在什么方面?
答：手性柱技術(shù)關(guān)鍵在于手性填料的開(kāi)發(fā)，大賽璐公司在手性填料的生產(chǎn)技術(shù)方面申請(qǐng)了zhuan利保護(hù)，別的廠商不能生產(chǎn)，導(dǎo)致手性柱價(jià)格居高不下。前幾年傳說(shuō)該公司的zhuan利保護(hù)期限快到了，國(guó)內(nèi)有些公司就想著仿制生產(chǎn)。后來(lái)又聽(tīng)說(shuō)zhuan利還沒(méi)到期，情況不明。
47.“樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)”這句話(huà)是什么意思?離子對(duì)怎么樣掩蔽化合物中極性基團(tuán)?不就是通過(guò)靜電引力的作用形成離子締合物，來(lái)降低其極性的嗎?
答：離子對(duì)色譜是解決強(qiáng)極性物質(zhì)在反相色譜中保留能力不足的一個(gè)有效的途徑。有些堿性極性物質(zhì)，即使用100%水相做流動(dòng)相，且無(wú)論在色譜柱能承受的pH范圍內(nèi)怎么去調(diào)節(jié)pH，保留能力都不夠。如果需要分離的組分中全是可以離子態(tài)存在的，那還可以選擇離子交換色譜進(jìn)行分離。不然的話(huà)，就只有選擇離子對(duì)色譜方法了，盡管它有流傳的那么多副作用存在。
離子對(duì)試劑含親水基和疏水基，很像表面活性劑，所以一開(kāi)始離子對(duì)色譜也稱(chēng)為“皂色譜”。離子對(duì)作用的機(jī)理有兩種解釋?zhuān)闵厦娑家呀?jīng)提到了。到底是哪種解釋對(duì)，尚無(wú)定論，實(shí)際上也沒(méi)必要去定論，反正兩種解釋都通就可以了。主流的解釋也是你先提到的機(jī)理，下面示意圖更直觀：
我個(gè)人認(rèn)為，兩種機(jī)理都可能存在，要看離子對(duì)試劑、固定相和分析物這三者本身情況而定。如果離子對(duì)試劑的疏水端和固定相之間的結(jié)合力相對(duì)更強(qiáng)，示意圖的作用機(jī)理會(huì)占上風(fēng)。反之，離子對(duì)試劑親水端和分析物導(dǎo)致掩藏極性端的作用力更強(qiáng)，你后面提到的機(jī)理更可能?？傊?，要看你用的什么離子對(duì)試劑，是何種的分析物等具體情況不同而不同吧。
48.我們?cè)谟玫陌被鶗r(shí)，有時(shí)候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時(shí)間就又好了，不明白是什么原因造成的，如果要再生氨基柱的時(shí)候應(yīng)該怎么做呢?是像您先前回答的問(wèn)題中提到的，用一定比例的氨水沖洗嗎?氨基柱可以直接用純水沖洗嗎?記得當(dāng)時(shí)買(mǎi)的氨基柱那個(gè)使用說(shuō)明書(shū)上說(shuō)不能用純水沖?是這樣的嗎?如果可以沖的話(huà)，一般沖多久?
答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高(大約有1mol/L)，在有水存在的時(shí)候，在孔內(nèi)形成一個(gè)pH=10左右甚至超過(guò)10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境，并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過(guò)硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基，又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程。一段時(shí)間后，兩個(gè)相反的過(guò)程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來(lái)。對(duì)你問(wèn)題提到的這個(gè)現(xiàn)象，我想到的是這個(gè)原因。
氨基柱，要看氨基柱的應(yīng)用模式，是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水，但HILIC模式應(yīng)用，一般流動(dòng)相是乙腈/水，是不怕水的。不過(guò)，鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí)，流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水，但清洗柱子上的污染物質(zhì)，是可以含水的，因?yàn)?，水有?qiáng)極性，在正相色譜上洗脫能力*，當(dāng)然不*100%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。
49.采用國(guó)標(biāo)用C18柱測(cè)定辣椒精辣度，將辣椒精中添加吐溫系列乳化劑做成水溶辣椒精，請(qǐng)問(wèn)乳化劑對(duì)C18柱是否有影響?
答：乳化劑和離子對(duì)試劑類(lèi)似，有極性端和非極性端，肯定會(huì)對(duì)C18柱有影響。不過(guò)，如果辣椒精是極性物質(zhì)，乳化劑的存在可以提高其在C18柱上的保留能力。
50.公司按照國(guó)標(biāo)測(cè)定辣椒紅色素中蘇dan紅含量，標(biāo)品分離很好，峰也不錯(cuò)，但是，辣椒紅色素由于跟蘇dan紅性質(zhì)很相似，且顏色較深，分離效果很差，收得率很低，測(cè)定結(jié)果偏差很大。該如何處理樣品?色素是否會(huì)降低柱效?
答：色素不會(huì)降低柱效，但，辣椒紅色素主峰濃度過(guò)大，會(huì)影響與臨近雜質(zhì)峰的分離?？煽紤]稀釋樣品或試試用柱效更高的柱子。
51.通常我們?cè)诜治鎏烊凰幬锍煞值臅r(shí)候結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法考察組分的PKa值，哪我們?nèi)绾稳ミx擇合適的流動(dòng)相或者是拖尾該怎么改善呢?
答：如果天然產(chǎn)物中沒(méi)有易電離的極性基團(tuán)，就不需要用緩沖鹽調(diào)節(jié)pH。如果，天然產(chǎn)物中既有酸性基團(tuán)，也有堿性基團(tuán)，譬如，有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質(zhì)，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4(如果是，諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調(diào)得更低)。
如果pH控制在6.2～9.0之間，兩個(gè)基團(tuán)都處于離子態(tài)，保留能力差，是不可取的。如果不清楚復(fù)雜物質(zhì)中含有什么基團(tuán)，也請(qǐng)將pH調(diào)到2.4或更低。因?yàn)閜H調(diào)低，起碼抑制了酸性基團(tuán)的電離而處于中性分子狀態(tài)，而增加酸性基團(tuán)這個(gè)部分在反相色譜中的保留能力;另外，低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對(duì)稱(chēng)的峰形。
情況不明時(shí)候，為什么不建議調(diào)高pH呢?一方面一般色譜柱都不能承受pH=9以上的條件;即使是像月旭的X-timate系列一樣能耐12.5的柱子，調(diào)高pH和調(diào)低pH相比，還有一個(gè)硅醇基活性大的劣勢(shì)。
52.記得以前拿到C18柱，會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢?是先用溶劑活化嗎?然后再用樣品?還有測(cè)定短肽總是沖出來(lái)，該怎么解決呢?就是和溶劑峰出在一起，或者出在溶劑峰之前。
答：C18柱，會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因?yàn)?，色譜柱到達(dá)用戶(hù)手中時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)短不一，在存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，可能存儲(chǔ)液有些揮發(fā)，低流速的甲醇可以很好的浸潤(rùn)固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統(tǒng)后，可以采取多次進(jìn)樣或者加大進(jìn)樣量的方式以更快的獲得重現(xiàn)的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活化點(diǎn)飽和，就不會(huì)出現(xiàn)異常色譜現(xiàn)象的情況。
53.C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會(huì)對(duì)柱子有什么損壞嗎?pH在2左右。
答：pH=2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括：C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對(duì)更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果，不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動(dòng)相中，也不bi過(guò)份擔(dān)心，多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點(diǎn)，保存期間水分揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對(duì)柱子損傷很大。
54.色譜柱的安裝有什么技巧嗎?只要保證不漏就行了嗎?還有所謂的死體積怎么測(cè)定呢?
答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實(shí)擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是*不保留的物質(zhì)出峰時(shí)從進(jìn)樣到流過(guò)色譜柱的總體積，一般用極性非常強(qiáng)的尿嘧啶的出峰來(lái)測(cè)定。死體積包括柱體積(色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積)和柱外體積兩部分。
你從廠商這里買(mǎi)到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長(zhǎng)度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否，保護(hù)柱或在線(xiàn)濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對(duì)這個(gè)有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴(kuò)散外，還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外，那就只有擴(kuò)散這個(gè)使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。
峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問(wèn)題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題，可以說(shuō)如果色譜柱類(lèi)型選擇沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成(包括：添加劑)、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響。另外，測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。
55.測(cè)定多肽樣品時(shí)，十幾肽或者二十幾肽時(shí)，有時(shí)峰前延的比較厲害，有時(shí)峰拖尾比較厲害，這是什么原因呢?是樣品的問(wèn)題還是柱子的問(wèn)題?
答：峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問(wèn)題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題，可以說(shuō)如果色譜柱類(lèi)型選擇沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇，包括：進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成(包括：添加劑)、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響，另外，測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。
56.柱子的平衡時(shí)間跟填料關(guān)系大嗎?哪種快，哪種慢?因?yàn)槲以谧鲭x子交換柱的時(shí)候平衡是相當(dāng)?shù)穆?
答：根據(jù)色譜速率理論，粒徑越小，柱效越高，而且當(dāng)粒徑小到亞2微米左右時(shí)，線(xiàn)速度的提高，其分離度就不再降低，從而，改變了許久以來(lái)人們不得不在 “速度和分離度之間取舍”的局面。
57.關(guān)于配置流動(dòng)相，有機(jī)相我們可以甲醇乙腈同時(shí)用，這個(gè)是基于什么考慮的?是不是根據(jù)甲醇乙腈選擇性不同、樣品在這個(gè)兩者的溶解度的差異以及調(diào)節(jié)洗流動(dòng)相脫能力來(lái)考慮的?
答：甲醇和乙腈同時(shí)用，可以獲得單純的甲醇或者乙腈不一樣的選擇性，而且洗脫能力也會(huì)改變，根據(jù)多元流動(dòng)相的強(qiáng)度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb純?nèi)軇゛和b的溶劑強(qiáng)度因素;ψa、ψb分別為a和b的體積分?jǐn)?shù)，所以，在藥典中有很多體系都使用甲醇乙腈體系。
58.三乙胺磷酸鹽緩沖液作流動(dòng)相，柱壓一天比一天高，該怎么樣解決?
答：把柱子再生下，再生的方法搜一下有很多反沖對(duì)絕大部分色譜柱都是可行的，效果不錯(cuò)。
59.新出廠液相色譜柱，保護(hù)溶劑一般是什么?怎樣進(jìn)行平衡清洗比較好，一般要平衡多長(zhǎng)時(shí)間比較好?
答：柱子類(lèi)型不同，保存溶劑也會(huì)不一樣吧，具體要看說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明。對(duì)于反相柱，一般用甲醇(乙腈)保存，也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動(dòng)相平衡沖洗10～20個(gè)柱體積即可。(注意：柱體積不等于空柱管體積，4.6×250mm的色譜柱空柱管體積是4.15mL，而柱體積只有約2.5mL)
60.據(jù)說(shuō)液相色譜柱柱壓達(dá)到一定高度就不能使用了，請(qǐng)問(wèn)一般達(dá)到多高，用甲醇和乙腈是不是不一樣?
答：柱壓不是色譜柱不能使用的唯yi因素，分離度才是重要的。柱壓只要沒(méi)高到儀器不能承受的地步，例如，超過(guò)300bar，就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高，同樣狀況的柱子，如果用甲醇做流動(dòng)相，柱壓可能超了，換用乙腈會(huì)使柱壓下降不少，儀器還能承受。不過(guò)盡管柱壓還沒(méi)上升到接近400Bar的限定，如果，發(fā)現(xiàn)柱壓上升速度較快，也需要及早對(duì)柱子進(jìn)行清洗維護(hù)，從根本上排除導(dǎo)致柱壓上升的源頭。
61.柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會(huì)有什么不良后果?
答：不建議將柱篩板拆下清洗，因?yàn)椋鹣鲁袎旱闹Y板會(huì)導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對(duì)污染的色譜柱先進(jìn)行清洗維護(hù)，維護(hù)沒(méi)有效果，再把拆洗柱篩板作為后的手段。
62.一般正常使用一個(gè)C18柱能用多長(zhǎng)時(shí)間?
答：柱壽命一般不按時(shí)間計(jì)算，按持續(xù)進(jìn)樣針數(shù)比較科學(xué)。一般正常使用維護(hù)，不超過(guò)pH和溫度等范圍，C18柱能達(dá)到500～2000針進(jìn)樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。
63.超高壓快速高分離度色譜柱是不是未來(lái)液相色譜柱普及應(yīng)用的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)?
答：這是個(gè)大話(huà)題，今后使用，會(huì)越來(lái)越多是肯定的，但是否會(huì)替代普通壓力的液相還有爭(zhēng)議。超高壓也有使用上的不便，譬如容易堵，對(duì)設(shè)備硬件要求高等。有機(jī)會(huì)我再談?wù)劤邏阂合嗌V方面詳細(xì)的一些情況。
64.如果液相色譜譜圖基線(xiàn)漂移很大是不是柱子的問(wèn)題?波長(zhǎng)越小的越大，270nm的還不怎么能看出來(lái)，230nm的就非常厲害了，有可能是什么原因造成的?
答：有可能是你的流動(dòng)相的問(wèn)題，230可能已經(jīng)快到你流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)了，當(dāng)然，紫外吸收強(qiáng)，基線(xiàn)漂移厲害。
65.我們有一臺(tái)waters1525色譜儀，近基線(xiàn)總是呈現(xiàn)波浪形很有規(guī)律，波長(zhǎng)越小越明顯，梯度洗脫時(shí)向上飄逸而且后一段時(shí)間呈現(xiàn)波浪形，很影響分析，我想問(wèn)一下，是不是柱子的原因，用的是C18上海安普的?
答：應(yīng)該是流動(dòng)相組成變引起吸收本底變化造成的，特別是在波長(zhǎng)小的時(shí)候，乙腈的截止波長(zhǎng)低于200nm，但甲醇和水相對(duì)比較高，在低波長(zhǎng)時(shí)，甲醇和水有一定的本底吸收。梯度進(jìn)行時(shí)，隨著不同本底的組分含量的變化，基線(xiàn)也會(huì)有相應(yīng)的波動(dòng)。
66.我是做農(nóng)藥殘留分析的，用的是UV2487檢測(cè)器，想問(wèn)一下，C18色譜柱用什么緩沖液比較好，我以前做三聚氰胺是用檸檬酸，辛烷磺酸鈉，也用農(nóng)藥檢測(cè)行不行?還有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的雜質(zhì)?
答：C18色譜柱用用磷酸鹽，醋酸鹽就比較好啊，離子對(duì)試劑不是個(gè)好東東，你要慎用。我們做三聚氰胺用三氯yi酸。
67.液相色譜柱一般使用壽命多長(zhǎng)?不同類(lèi)型的色譜柱是否壽命也不一樣?液相色譜柱與氣相的柱子有何區(qū)別呢?
答：液相色譜柱一般使用壽命多長(zhǎng)!我有一根柱子，用了大約1年半左右，發(fā)現(xiàn)同樣濃度的樣品它的峰展寬了。說(shuō)明柱效下降。但是不影響結(jié)果。因?yàn)榉迕娣e還是接近。所以做色譜之前先做下柱子性能測(cè)試。次的圖譜要保留。 測(cè)試C18 RP柱，一般用到萘作為柱子的柱效判斷。一般是18000片，對(duì)稱(chēng)性(usp)0.95～1.05間。
68.①“水相”指的是什么?純水?②我們實(shí)驗(yàn)室的CN基柱保存在40%的乙腈里面，這個(gè)有不良后果嗎?
答：水相就是純水。CN基不適合保存在中等極性的溶劑中，除了可以低溫保存在極性較大的純水中外，還有可以保存在非極性溶劑如正己烷中。40%乙腈水，屬于中等極性溶劑，短期過(guò)夜保存可能問(wèn)題不大，長(zhǎng)期保存不太好，后果就是可能會(huì)發(fā)生柱床坍塌。
69 CN基柱應(yīng)該怎樣維護(hù)才好呢?比如，做完實(shí)驗(yàn)用什么流動(dòng)相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長(zhǎng)期用什么溶劑保存等。
答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護(hù)辦法和一般正相和反相柱沒(méi)有多大區(qū)別。
70.月旭公司的液相色譜柱接頭是大眾的還是有自己的規(guī)格，我們是waters的分析儀，有月旭的產(chǎn)品可不可以?
答：月旭公司的色譜柱柱頭的規(guī)格是大眾的，因?yàn)槲覀円膊蛔约荷a(chǎn)柱管和柱頭，月旭的柱管柱頭供貨商也是和一些Waters、Agient和Phenomenex一樣的，也許是同一家。月旭柱頭規(guī)格標(biāo)配是Valco型，但也可以按照客戶(hù)要求提供Parker型和Waters型。
你用Waters的儀器，而開(kāi)始也用的是Waters柱子，如果是用不銹鋼接頭，匝扣的位置就固定了。如果用月旭的柱子，可以把固定匝扣位置的那段剪掉，換一個(gè)新的匝扣就可以重新固定匝扣位置。當(dāng)然，如果你已換成peek接頭，問(wèn)題就不會(huì)很大。
71.色譜柱的接頭，出口處用的是peek接頭，請(qǐng)問(wèn)都用peek接頭不行么，為什么?
答：都用peek接頭我認(rèn)為都可以的，當(dāng)然，peek接頭的質(zhì)量要過(guò)關(guān)。有人認(rèn)為peek接頭不耐壓，估計(jì)是針對(duì)品質(zhì)不好的產(chǎn)品說(shuō)的。
72.我們的液相，為了節(jié)約成本我們自己填保護(hù)柱，用廢的同型號(hào)柱子填。但填完以后做標(biāo)樣定量分析有所改變。請(qǐng)問(wèn)其原因。
答：不建議自己填保護(hù)柱柱芯，填得不好的柱芯會(huì)影響分離效果，也會(huì)影響定量分析結(jié)果。你不知道廢柱子里的填料是不是受了污染，另外你填的柱芯肯定沒(méi)有廠商填得好，如果影響到峰形，峰面積積分結(jié)果有所改變是可能的。
73.請(qǐng)問(wèn)怎么測(cè)柱效?(柱子填料是Sino Chrom ODS-BP 5μm，規(guī)格4.6mm×200mm)
答：測(cè)定柱效不同公司不一樣，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有檢測(cè)報(bào)告，你按照?qǐng)?bào)告里的方法做一遍就可以。
74.我用苯試了一下，峰性大大好，但是，不知道理論塔板數(shù)，不知道怎么評(píng)價(jià)，感覺(jué)不大好，對(duì)稱(chēng)性不好，有點(diǎn)前延，柱子才用了四個(gè)月，是什么原因呢?是不是塌陷了呢?有什么補(bǔ)救的辦法嗎?
答：用了四個(gè)月峰形拖尾是很正常的，需要維護(hù)清洗一下色譜柱以清除引起拖尾的柱頭污染。如果柱頭塌陷，則不好辦，從其它廢柱子里取點(diǎn)填料填補(bǔ)塌陷，可以一試，但效果不一定好。色譜柱是耗材，測(cè)定進(jìn)樣針數(shù)如果達(dá)到500以上了，也算是物有所值，物盡其用了，報(bào)廢了也不可惜。
75.流動(dòng)相里之前有酸的，做完后單純用乙腈沖洗，能把酸沖洗干凈嗎?之前，他們是這樣沖的，現(xiàn)在懷疑柱子塌陷了，會(huì)不會(huì)是長(zhǎng)時(shí)間在酸性環(huán)境中造成的呢?
答：流動(dòng)相里有酸，應(yīng)該先用純水或80：20的水/乙腈溶劑沖洗吧。如果，一直在酸性環(huán)境，固定相容易流失，造成保留時(shí)間前移和其它色譜性能下降。
76.我前一段時(shí)間做三聚氰胺用C18色譜響應(yīng)值很小，幾乎無(wú)法檢測(cè)，可是檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)就是用的C18，后來(lái)我用RP18結(jié)果響應(yīng)值很好，不知道什么原因，請(qǐng)問(wèn)這兩個(gè)柱子不都是反相色譜柱么?他倆之間有什么不同?
答：RP18就是C18吧，不過(guò)C18柱之間也有區(qū)別，測(cè)定三聚氰胺一般要用極性比較大的水性C18柱。
77.磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基共聚物為填充劑的色譜柱在儲(chǔ)存過(guò)程未注意放在冰箱中，導(dǎo)致發(fā)霉后，柱效急劇下降，能何種方法將此色譜柱修復(fù)好?
答：聚合物柱子因?yàn)椴慌滤釅A，就直接用強(qiáng)酸強(qiáng)堿清洗。如果是H型，用1M硫酸沖洗;如果是Ca型，可以先用1M硫酸沖洗，再用EDTA鈣鹽轉(zhuǎn)換回Ca型柱;如果是中性的聚合物反相柱，直接用1M的NaOH沖洗。
78.我有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性檢測(cè)分析方法它是建立在某一供應(yīng)商的碳18柱上我知道有另一個(gè)廠家生產(chǎn)同樣的碳18柱但價(jià)錢(qián)是它的一半如果我更換柱子會(huì)不會(huì)影響到分析方法。。。
答：要看這一分析方法的具體要求。如果方法中有說(shuō)明“使用某一色譜柱或與其同樣的柱子，”那么，就可以使用別的柱子來(lái)替換。但要注意，不能光看一個(gè)柱子標(biāo)為碳18柱，或是其宣傳等價(jià)于某某柱，就認(rèn)為該柱適用于所有方法。必須要驗(yàn)證色譜柱的等價(jià)性。
我們需要考查使用新柱子時(shí)，系統(tǒng)適應(yīng)性是否可以通過(guò)驗(yàn)證。如果可以獲得系統(tǒng)適用性測(cè)試中所要求的保留值，分離度以及其它參數(shù)等，就可以使用該柱。推薦使用系統(tǒng)適用性測(cè)試樣品以及其它的典型樣品來(lái)進(jìn)行考查，以保證雜質(zhì)和降解物在正確的保留時(shí)間出峰并給出正確的濃度響應(yīng);并且在新柱子上獲得的分析結(jié)果要等價(jià)于在原柱子上的結(jié)果。
79.請(qǐng)問(wèn)我做一種藥的分析查美國(guó)藥典規(guī)定使用100mm×40mm，8μm的色譜柱流速3mL/min可現(xiàn)在市場(chǎng)上已不容易找到這種規(guī)格的產(chǎn)品于是我按USP中色譜柱比較的數(shù)據(jù)庫(kù)的指引選了一款選擇性一致的等價(jià)色譜柱其規(guī)格是100mm×46mm，3μm的色譜柱當(dāng)選用3mL/min的流速時(shí)發(fā)現(xiàn)柱壓超高請(qǐng)問(wèn)我如何對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整以滿(mǎn)足USP的要求?
答：流速調(diào)整原則是流動(dòng)相通過(guò)柱子的線(xiàn)速度一致，等價(jià)柱的截面積大了，流速也應(yīng)增加才能保持相同的線(xiàn)速度。新流速計(jì)算結(jié)果是：(4.6/4.0)2×3.0=4.0mL/min。但3mL/min流速都已導(dǎo)致柱壓太高，4.0mL/min明顯不行。好在USP還有個(gè)允許±50%的流速調(diào)整指導(dǎo)原則，這樣將流速調(diào)至2.0mL/min既符合USP規(guī)定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。
這個(gè)例子中，等度分析中，流速改變會(huì)引起塔板數(shù)和峰寬的改變，但不會(huì)影響峰的選擇性。3μm粒徑色譜柱柱效比8μm的高很多，可考慮縮短柱長(zhǎng)以補(bǔ)償或部分補(bǔ)償流速降低造成的測(cè)定時(shí)間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6 mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運(yùn)行，可以在符合USP規(guī)定的情況下，又得到更快速的測(cè)定分離。
80.近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿(mǎn)意的結(jié)果。有人建議我對(duì)色譜條件，如進(jìn)樣量、流動(dòng)相pH和溫度等，進(jìn)行微調(diào)以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規(guī)定我不能這樣做，怎么辦?
答：如果你心里老有這個(gè)思維定勢(shì)“按規(guī)定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦!只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結(jié)果，你才能發(fā)現(xiàn)問(wèn)題所在。如果改變條件后，仍得不到好結(jié)果，就要去找色譜條件以外的原因，如，色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過(guò)程中的是否存在問(wèn)題?不管通過(guò)微調(diào)你是否取得了好結(jié)果，你也有了向領(lǐng)導(dǎo)匯報(bào)問(wèn)題和解決方案的依據(jù)。
而且，不能調(diào)整藥典規(guī)定色譜條件的說(shuō)法通常是不對(duì)的。美國(guó)藥典USP說(shuō)的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗(yàn)證，但方法調(diào)整或者稱(chēng)微調(diào)以符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗(yàn)證的。USP列了調(diào)整的幾條指導(dǎo)原則，如，±50%的流速調(diào)整，±10 °C的溫度調(diào)節(jié)等等(詳見(jiàn)"Chapter 621，Chromatography，”，United States Pharmacopeia No.31-NF 26，(2008).)。當(dāng)然既然是指導(dǎo)原則，這些規(guī)定都不是的，如溫度調(diào)整±10 °C，對(duì)有些方法適用，對(duì)另外的方法則±5 °C的調(diào)整都會(huì)有問(wèn)題，我們應(yīng)該依據(jù)具體情況作出明智的科學(xué)判斷。
81.請(qǐng)問(wèn)下HibarRT250-4這個(gè)柱子很特殊么?為什么很多藥典中的藥物分離都用它做柱子，因?yàn)椴砰_(kāi)始做藥，不知道hi，bar的柱子特點(diǎn)是什么?
答：HibarRT250-4是Merk的一個(gè)品牌，不是很了解。大概是共用柱頭，可更換的柱管。
82.在堿性條件下硅膠溶解，又生成硅羥基的機(jī)理是什么?反應(yīng)方程式如何寫(xiě)?
答：二氧化硅溶解的反應(yīng)式是：
SiO2+2OH-=Si032-+H2O或者表示成水解的形式：SiO2+H2O=Si032-+2H+
這說(shuō)明硅膠會(huì)在堿性條件下溶解而生成硅酸根，但，我們這里說(shuō)的是硅膠顆粒表面的部分溶解，含有鍵合固定相的硅膠原表面溶解脫落后，自然會(huì)生成新鮮的硅膠表面，而新鮮的硅膠表面結(jié)構(gòu)一般都是含有硅羥基的。硅膠基本結(jié)構(gòu)單元是Si-O-Si鍵，在OH-離子的作用下，Si-O鍵斷裂，在表面形成Si-O-H硅羥基的結(jié)構(gòu)單元。
必須指出的是，在氨基柱的孔內(nèi)，并沒(méi)有單獨(dú)加入OH-離子，偏堿小環(huán)境的形成是由于氨基易和水電離生成的氫陽(yáng)離子結(jié)合造成的游離OH-離子的過(guò)剩。從個(gè)方程式角度解釋?zhuān)坞x的OH-離子用完，硅膠就不再繼續(xù)溶解;從第二個(gè)水解形式方程式角度解釋?zhuān)寒?dāng)硅膠水解生成的H+離子足夠用來(lái)和氨基結(jié)合時(shí)，水解過(guò)程就會(huì)變慢或停止。
83.同樣都是C18柱子，液相色譜柱和SPE他們之間有什么區(qū)別，能具體講一下么?
答：HPLC柱子和SPE小柱的對(duì)比：
對(duì)比項(xiàng)目 HPLC SPE
柱管 不銹鋼管 塑料管
粒徑(um) 3，5，10 40-300
顆粒形狀 球形 一般為無(wú)定形
柱效(塔板數(shù)) 20-25000 <100
分離機(jī)理 連續(xù)洗脫 數(shù)字式開(kāi)關(guān)洗脫
售價(jià)(元) 1000-4000 10-40
使用方式 可重復(fù)使用 一次性使用
操作成本 較高 低
設(shè)備成本 高 低
※對(duì)于C18固定相，為了提高回收率，SPE里用的C18填料一般載碳量相對(duì)更高。
84.我從上面了解到RP18和C18的區(qū)別是極性強(qiáng)一些，能問(wèn)一下他們?cè)诜治鲛r(nóng)藥是可不可以通用?C18適用于那些農(nóng)藥的分析?我查材料看到苯醚甲環(huán)唑都是用C18分析的，可我用C18分析發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值很小，沒(méi)法分析能幫忙分析一下原因么?
答：RP18和普通C18，肯定有其不同的適應(yīng)性，農(nóng)藥種類(lèi)這么多，可能大部分農(nóng)藥兩者都能用，有些就不一定。你問(wèn)的C18適用于哪些農(nóng)藥，應(yīng)該從相關(guān)農(nóng)藥分析方面的書(shū)籍手冊(cè)中可以查到具體什么農(nóng)藥用什么色譜條件合適，其中里面肯定有選擇什么類(lèi)型柱子，我這邊沒(méi)辦法一一列舉。液相色譜中，60%以上的分析物可以用C18柱，我想也應(yīng)該有60%以上的農(nóng)藥可以用C18柱。
如果手冊(cè)或文獻(xiàn)中查不到，你把農(nóng)藥作為普通分析物來(lái)對(duì)待，然后按照一般的色譜柱選擇和方法建立原則來(lái)做就可以，選擇決定因素應(yīng)該也是農(nóng)藥分子的結(jié)構(gòu)。苯醚甲環(huán)唑，應(yīng)該含有極性基團(tuán)，可以試試極性強(qiáng)的C18柱。
85.我在用乙腈作流動(dòng)相時(shí)，只要那個(gè)乙腈比例稍高一點(diǎn)，比如，20%，即使，測(cè)量波長(zhǎng)高于乙腈截止波長(zhǎng)比較多，也會(huì)產(chǎn)生比較大的溶劑峰，這怎么回事?
答：如果出現(xiàn)溶劑峰，對(duì)你的分析結(jié)果沒(méi)任何影響，那就讓溶劑峰在那兒好了，或者你用規(guī)定的溶劑溶解提取樣品后，再用流動(dòng)相稀釋一下樣品，如果，稀釋后檢測(cè)限能達(dá)到的話(huà)。
86.我在做一個(gè)模擬胃內(nèi)容物中藥物反應(yīng)試驗(yàn)，需要?jiǎng)討B(tài)測(cè)定某藥品含量變化。分析時(shí)碰到一個(gè)棘手問(wèn)題，進(jìn)樣量同樣用20μL，用對(duì)照品進(jìn)樣時(shí)色譜峰形不錯(cuò)，進(jìn)樣品時(shí)卻一直不能得到好的峰形。后來(lái)分析是模擬胃內(nèi)容物樣品的酸度過(guò)高的因素，可我通過(guò)稀釋的方法讓樣品酸度和流動(dòng)相接近，雖然峰形沒(méi)問(wèn)題了，卻發(fā)現(xiàn)因稀釋導(dǎo)致分析物在樣品中含量下降，低于低檢測(cè)限了，如何是好呢?
答：稀釋很方便，但靈敏度更高的檢測(cè)器不容易找，不過(guò)還是有個(gè)簡(jiǎn)單的解決方案。當(dāng)用流動(dòng)相稀釋樣品時(shí)，只要稀釋后樣品中有機(jī)相含量比流動(dòng)相中的有機(jī)相比例低10個(gè)百分點(diǎn)以上(如，流動(dòng)相中甲醇含量是40%，則樣品中甲醇含量一定要低于30%)，樣品流動(dòng)會(huì)被色譜柱進(jìn)口端延緩或阻擋，稱(chēng)為“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在，這種情況下進(jìn)行大體積樣品進(jìn)樣，可避免樣品溶劑組成和流動(dòng)相一樣時(shí)進(jìn)樣量過(guò)大產(chǎn)生的“峰展寬”。針對(duì)你提的這個(gè)實(shí)例，可用稀的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH和流動(dòng)相匹配，并將樣品終稀釋一倍。將進(jìn)樣量提高一倍到40μL，就可達(dá)到低檢測(cè)限的要求。
87.峰形后拖尾是什么原因造成的?
答：
[柱物理?yè)p壞]
色譜柱有物理?yè)p壞是造成峰形拖尾的根源。唯yi的解決方法就是更換新柱。
[柱內(nèi)填料污染]
流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。
流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純?cè)噭?。流?dòng)相所用的水是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾(器)過(guò)濾，除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。
復(fù)雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾(器)或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)，或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積，或視具體情況而定;另外，此時(shí)不能接檢測(cè)器)，將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。
[柱進(jìn)口處有異物]
當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。
[樣品濃度過(guò)高致使柱超載]
樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾(或伸舌)。
適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度(需要時(shí)，可提高檢測(cè)器靈敏度)直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50μg范圍內(nèi)，不會(huì)引起明顯超載。
[樣品溶劑不對(duì)]
選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾，選用流動(dòng)相溶解樣品。
[柱外效應(yīng)]
柱外效應(yīng)(即，進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過(guò)長(zhǎng)、直徑過(guò)粗、管路接頭不匹配、有死體積)是影響色譜柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。
[緩沖不足或不合適]
在緩沖不好或離子強(qiáng)度過(guò)低的分離中，也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。
[硅醇基團(tuán)作用]
仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。
為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用，以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果，將抑制劑加至樣品中，效果會(huì)顯著。
[柱內(nèi)金屬污染]
柱內(nèi)金屬污染(Fe，Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動(dòng)相沉積到柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對(duì)稱(chēng)的。
88.流動(dòng)相與柱子如何才能做到匹配，達(dá)到的分離效果。目前我們實(shí)驗(yàn)室有購(gòu)買(mǎi)好的色譜柱，可是對(duì)樣品的分離效果不是很好。
答：不同填料的色譜柱都有自己的選擇性，相同填料不同廠家以及相同廠家不同品牌之間的選擇性都是不一樣的，一般情況下根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)將分離的大方向如：正相分析或者反相分析，確定后，一般可以根據(jù)調(diào)節(jié)色譜條件能得到好的色譜峰形，這方面的資料論壇當(dāng)中很多，但是也有些色譜柱不管怎么調(diào)整色譜條件都不行，表面這款色譜柱的選擇性不適合該樣品的選擇。
89.我用的是C18柱，后面黑色的是我以前跑的圖，前面是我現(xiàn)在跑的圖形，*一樣的東西，只是流動(dòng)相不是一批配的(流動(dòng)相的成分沒(méi)變)，中間柱子別人用過(guò)了，峰型怎么發(fā)生了這么大的變化啊?可能的原因是什么啊?是不是柱子出了問(wèn)題啊?
答：從兩個(gè)圖對(duì)比很明顯可以看出是柱效嚴(yán)重下降，且伴有肩峰。不同時(shí)間配的流動(dòng)相，如果成分和pH沒(méi)變的話(huà)，肯定不會(huì)造成這個(gè)結(jié)果。估計(jì)是別人用柱子過(guò)程中，造成了柱頭塌陷、柱頭污染以及固定相流失等嚴(yán)重問(wèn)題，如樣品太臟，流動(dòng)相或樣品pH太高或太低，都會(huì)造成這個(gè)結(jié)果。
你可以試著用色譜柱清洗和再生的方法反沖維護(hù)一下，但不能保證一定能回到原來(lái)的效果。再生如果不行，考慮挖補(bǔ)柱頭填料，實(shí)在不行，柱子也只能報(bào)廢。建議柱子還是專(zhuān)門(mén)用于一種方法比較好，像你這種情況，都搞不清別人怎么用柱子的，分析解決問(wèn)題就相當(dāng)難。
90.柱子的柱效影響大嗎?一般柱子的柱效規(guī)定是多少的呀!理論塔板數(shù)一般要達(dá)到多少呢?主要有那些因素影響它。
答：柱效是柱子性能好壞的一個(gè)重要體現(xiàn)指標(biāo)。柱效會(huì)影響分離度，當(dāng)然是峰形越尖銳，柱效越高，和其它峰越容易分開(kāi)。另外柱效高峰形尖銳，對(duì)峰面積的積分誤差就小，甚至可以用峰高來(lái)定量。
一般C18柱，在測(cè)定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質(zhì)時(shí)，5μm的填料，每米的柱效能達(dá)到80000以上的塔板數(shù)，就算合格吧。在實(shí)際分析物的測(cè)定時(shí)，一般藥典有規(guī)定低柱效是2000～3000，一般新柱子的柱效都高于這個(gè)數(shù)。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效會(huì)逐步下降，當(dāng)下降到不符合藥典低柱效要求，或者導(dǎo)致分離度不夠時(shí)，色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個(gè)角度看，柱效高的色譜柱相對(duì)使用壽命更長(zhǎng)。
影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等，柱子裝填緊密、柱床均勻一致也對(duì)提高柱效有好處。這些影響因素中，很多是和生產(chǎn)廠商有關(guān)，你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。
91.流動(dòng)相中加入四氫fu喃對(duì)柱子有損害嗎?我現(xiàn)在分析一樣品流動(dòng)相中用到20%的四氫fu喃才能把峰分到基線(xiàn).但柱子只能用一個(gè)星期分離效果就不好了.請(qǐng)問(wèn)是四氫fu喃損壞了柱子嗎?
答：四氫fu喃(THF)是反相色譜中洗脫能力*的溶劑，比甲醇和乙腈都強(qiáng)很多。在流動(dòng)相中加入THF能改善某些難分離的物質(zhì)對(duì)的分離度，但，THF不穩(wěn)定，容易降解生成具有很強(qiáng)反應(yīng)活性的過(guò)氧化物，能與分析物反應(yīng)生成新化合物，導(dǎo)致拖尾、峰分裂和鬼峰產(chǎn)生。高反應(yīng)活性的過(guò)氧化物還可以和填料固定相發(fā)生化學(xué)作用，THF對(duì)柱子有損傷這點(diǎn)是無(wú)疑的，而且這種損傷是隨時(shí)間累積的。THF保質(zhì)期一般規(guī)定是6個(gè)月，放得越久，里面產(chǎn)生的過(guò)氧化物含量越大，你應(yīng)該避免使用生產(chǎn)日期已很久的THF溶劑，而且將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前能檢測(cè)一下過(guò)氧化物的含量。
92.在用液相色譜同時(shí)分離多種組分時(shí)，怎么通過(guò)條件色譜條件使各個(gè)峰達(dá)到比較理想的分離效果!
答：這是方法開(kāi)發(fā)的大問(wèn)題。方法開(kāi)發(fā)建立，要做的就是：針對(duì)分析物和基體的情況不同，選擇色譜柱類(lèi)型和分析條件，包括流動(dòng)相溶劑類(lèi)型、組成比例、pH值、溫度和流速等參數(shù)的確定。這方面的問(wèn)題，要講起來(lái)內(nèi)容非常多。
93.是樣品過(guò)載問(wèn)題,按藥典檢測(cè)方法檢驗(yàn)一些藥品有關(guān)物質(zhì)時(shí),都要注入高濃度的供試液,這樣往往使得柱過(guò)載而峰變形,按老師的方法減小濃度和注入量均是不允許的,怎么處理這問(wèn)題?
答：藥典方法中注入高濃度供試液測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，提高注入濃度是為了把雜質(zhì)峰的信號(hào)增強(qiáng)。有時(shí)候?yàn)榱税央s質(zhì)峰顯現(xiàn)出來(lái)，主峰因過(guò)載有所變形，如在允許范圍內(nèi)，也能接受。但前提是雜質(zhì)峰和樣品主峰分開(kāi)，如果因過(guò)載而使兩峰沒(méi)有得到需要的分離度，雜質(zhì)峰信號(hào)再?gòu)?qiáng)也失去了意義。我認(rèn)為藥典規(guī)定的條件是允許在一定范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，因?yàn)樗幍錄](méi)有規(guī)定具體使用色譜柱的品牌，而不同品牌的柱子，上樣量是有差異的。對(duì)色譜條件微調(diào)，并取得到了很好的分析結(jié)果，如果規(guī)定不允許，那你首先要懷疑這個(gè)規(guī)定是否合理，或者是否對(duì)規(guī)定的理解有問(wèn)題。
94.哪些原因會(huì)造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法?
答：確實(shí)是這樣，如果其它色譜條件沒(méi)有改變，柱效下降是導(dǎo)致峰變寬的主要原因。對(duì)于易電離的極性物質(zhì)，如果流動(dòng)相pH選擇不合適，分析物既有中性分子態(tài)存在，又有離子態(tài)存在，峰也會(huì)變寬變矮。
色譜柱使用后柱效逐步下降是正?，F(xiàn)象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是使用不當(dāng)，造成填料特性或柱床結(jié)構(gòu)改變所致。如超過(guò)使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等;還有強(qiáng)保留物質(zhì)吸附在填料表面，形成非特異性吸附層，*改變了原有固定相的表面活性和分離性能，使柱效下降;另外進(jìn)樣時(shí)的壓力脈沖，也會(huì)破壞柱床結(jié)構(gòu)影響柱效。
95.我以前做dan紅用的是安捷倫的SB-C18柱，峰形什么都很好，近發(fā)現(xiàn)4個(gè)標(biāo)樣峰后都帶有一個(gè)小峰，一開(kāi)始以為是標(biāo)樣問(wèn)題，后來(lái)?yè)QXDB-C18后標(biāo)樣又正常了。可是用SB-C18柱做其他用正常，不知怎么回事?還有，像這種C18柱如果壓力過(guò)高能不能反沖，該如何沖洗?一般做獸殘、農(nóng)殘什么的，而且感覺(jué)三聚氰胺做后壓力更易增高，且容易引發(fā)進(jìn)樣器漏等問(wèn)題，請(qǐng)問(wèn)做完三聚氰胺需對(duì)系統(tǒng)做特殊清洗嗎?
答：用SB柱，標(biāo)樣后帶一小峰，而且是只對(duì)蘇dan紅標(biāo)樣測(cè)定時(shí)有，估計(jì)和蘇dan紅標(biāo)樣的測(cè)定方法和其它樣品測(cè)定方法不同有關(guān)。能把譜圖貼上來(lái)看看，是什么樣的小峰?才能判斷是溶劑峰還是雜質(zhì)峰。XDB柱和SB柱是有區(qū)別的，XDB鍵合度高，封尾良好，反相保留能力強(qiáng);而SB柱，未進(jìn)行封尾，對(duì)極性物質(zhì)選擇性好。有可能你的蘇dan紅標(biāo)樣分解了，有極性雜質(zhì)生成，SB柱能把雜質(zhì)分開(kāi)，而XDB柱不能。
這兩款柱子壓力大了，可以反沖。有正常維護(hù)時(shí)的反沖沖洗和再生時(shí)的強(qiáng)溶劑沖洗兩種，沖洗方法在在線(xiàn)講座里也寫(xiě)了，你再回到本貼的前面看看就可以了。
三聚氰胺和三乙胺類(lèi)似，本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面，另外三聚氰胺測(cè)定的樣品基體含蛋白類(lèi)的強(qiáng)保留物質(zhì)較多，容易污染色譜柱柱頭引起填料間隙堵塞柱壓升高，每次做完樣后，都用甲醇或乙腈反向清洗維護(hù)一下。如有蛋白類(lèi)的污染，也定時(shí)用本講座中提到的清洗方法做一下維護(hù)。
96.我是做農(nóng)藥殘留分析的，不同的基質(zhì)雜質(zhì)含海量是不同的，我用C18分析時(shí)有可能一次就污染了，我用高流速，和反向沖洗都解決不了，是不是這根柱子就廢了，有沒(méi)有其他的辦法?
答：高流速反向沖洗是對(duì)的，關(guān)鍵你用了什么溶劑沖洗呢?用原來(lái)的流動(dòng)相沖洗肯定不管用，要不然就不會(huì)累積在柱子上了。你應(yīng)該用流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑B沖洗，如果不行，就需要啟用再生的程序，當(dāng)然再生時(shí)用的溶劑更強(qiáng)。
100%甲醇——100%乙晴——75%乙晴/25%異丙醇——100%異丙醇——100%二氯甲烷——100%正己烷。
用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2mL/min。后，用10柱體積的異丙醇過(guò)渡，然后回到原來(lái)的流動(dòng)相體系。
再生還不解決問(wèn)題，后一招就是挖補(bǔ)柱頭填料，把柱頭污染的填料挖掉，用干凈填料填補(bǔ)進(jìn)去。挖補(bǔ)填料，破壞原有柱床結(jié)構(gòu)，挖補(bǔ)后柱效也不可能有新柱水平，或許能再維持一段時(shí)間，但不會(huì)長(zhǎng)久。
97.還有溶劑中的金屬過(guò)濾頭生銹了，會(huì)有什么影響?會(huì)不會(huì)影響到柱子的壽命，金屬離子和柱子有沒(méi)有什么反應(yīng)?
答：我覺(jué)得你就把銹當(dāng)成顆粒物污染的一種，會(huì)導(dǎo)致拖尾、柱壓上升等。溶解的金屬離子一般在反相柱上沒(méi)有什么保留能力，馬上就會(huì)被沖出柱子，不會(huì)和固定相或者和硅膠基質(zhì)反應(yīng)。
98.如果在溶劑過(guò)濾時(shí)把水膜當(dāng)成有機(jī)膜了溶解了而且這樣的溶劑又做有機(jī)相用了，造成C18柱壓由1000升到3000，流動(dòng)相是乙腈和水，問(wèn)一下這樣的柱子還能用么?有沒(méi)有什么補(bǔ)救方法?
答：溶解的膜作為了顆粒物堵塞篩板，引起柱壓上升，也只有反沖一下，如果能把堵在篩板上的膜殘?jiān)鼪_走，柱壓下降了就OK了;如果，殘?jiān)M(jìn)入了柱子內(nèi)部的填料間隙，會(huì)難沖一點(diǎn)，也只能多沖一會(huì)吧，實(shí)在不行，你又舍不得把色譜柱報(bào)廢，就只有挖補(bǔ)柱頭填料和換篩板了。
99.保護(hù)柱和預(yù)柱的作用是不是一樣的，如果不一樣有什么區(qū)別么?保留時(shí)間漂移多少為可以接受的范圍?
答：保護(hù)柱一般帶填料，相當(dāng)于一根縮短了的色譜柱(一般是1～2cm長(zhǎng)度)，卡套里可更換的柱芯，柱管、篩板和填料都有。保護(hù)柱里的柱芯好像是在前面開(kāi)路的掃雷bu隊(duì)，流動(dòng)相和樣品里如有什么損害柱子的污染物，保護(hù)柱就自己承受了下來(lái)。
而預(yù)柱，現(xiàn)在一般指的就是接在進(jìn)樣器和色譜柱之前的在線(xiàn)過(guò)濾器。在線(xiàn)過(guò)濾器和保護(hù)柱的大區(qū)別是不帶填料，只有可更換的篩板。預(yù)柱只能保護(hù)色譜柱免受顆粒物質(zhì)的污染，而不能阻擋溶解在流動(dòng)相中的強(qiáng)保留物質(zhì)。
保留時(shí)間是液相色譜中一個(gè)很有用的診斷分離問(wèn)題的工具。保留時(shí)間受流動(dòng)相組成、溫度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影響，如果所有這些參數(shù)保持不變，保留時(shí)間也保持恒定。但在實(shí)際操作中，不可能對(duì)每個(gè)色譜參數(shù)進(jìn)行很的控制，如即便加了柱溫箱，溫度還是會(huì)有波動(dòng);流動(dòng)相組成會(huì)因組分揮發(fā)性不同而改變。
所以，保留時(shí)間有上下0.02～0.05min的變動(dòng)是非常正常的，對(duì)某些方法有0.1min上下變動(dòng)也屬正常。保留時(shí)間有大的變化，預(yù)示著系統(tǒng)和方法存在問(wèn)題。流路里有氣泡存在，泵閥有泄漏，會(huì)因流量降低而導(dǎo)致保留時(shí)間增加。梯度混合比例閥故障也是保留時(shí)間變化原因之一。
100.液相色譜柱與氣相的柱子有何區(qū)別呢?
HPLC是走液體的。分正相，反相。反相為例。Si 接著C18(鍵和相),電鏡下看起來(lái)像絨毛一樣的。所以一般用甲醇，乙腈保護(hù)RP柱。這樣它的絨毛呈舒展?fàn)睢C 走氣體的。固定相涂布固定液。
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